——無需染料，120nm分辨率，極低光毒性，開啟活細胞成像新篇章
近日，斯坦福大學W. E. Moerner教授團隊在《Light: Science & Applications》期刊發(fā)表了一項突破性研究成果——干涉圖像掃描顯微技術（iISM）。該技術首次將干涉散射顯微鏡與圖像掃描顯微術相結合，在活細胞內部實現(xiàn)了約120nm的橫向分辨率，同時將所需照明功率降低至傳統(tǒng)方法的十分之一。值得一提的是，該項研究中使用的445 nm激光器，正是來自Cobolt公司。
從“有毒”的熒光到“溫和”的無標記成像
在生命科學領域，光學顯微鏡是不可或缺的研究工具。傳統(tǒng)熒光成像雖然能夠清晰地標記特定分子，但熒光染料的引入常常伴隨著光毒性、標記效率受限以及對生物功能的干擾等問題。多年來，科學家們一直期待一種能夠在不損傷活細胞的前提下，依然保持高分辨率和高對比度的成像方法。
干涉散射顯微技術（iSCAT）的出現(xiàn)為這一目標提供了可能。該技術通過檢測納米結構對光的散射信號，無需任何染料或遺傳標記即可實現(xiàn)高靈敏度探測。然而，將iSCAT應用于活細胞成像面臨一個核心挑戰(zhàn)：細胞內部復雜的異質結構會產(chǎn)生散斑噪聲，嚴重降低圖像質量。此前雖有研究通過共聚焦照明和探測方案在一定程度上解決了這一問題，但成像所需的光照功率仍然較高，制約了其在敏感細胞樣本上的應用。
iISM：三項技術的巧妙融合
Moerner教授團隊開發(fā)的干涉圖像掃描顯微技術（iISM），巧妙地將三項關鍵技術融為一體：干涉散射檢測提供無標記對比度，圖像掃描顯微術提升分辨率，以及研究團隊專門開發(fā)的適應性強像素重分配算法（APR）處理相干信號。
這套系統(tǒng)的核心光源正是Cobolt MLD-06-01型445 nm二極管激光器。在整個實驗過程中，該激光器為系統(tǒng)提供穩(wěn)定的445 nm照明光，經(jīng)過單模光纖空間濾波后，通過偏振分束器和四分之一波片轉換為圓偏振光，最終聚焦到樣本平面。研究團隊之所以選擇圓偏振光，是因為其能夠在高數(shù)值孔徑條件下提供更好的旋轉對稱性，這直接關系到最終成像的分辨率和信噪比。論文中的實驗數(shù)據(jù)清晰表明，采用圓偏振光后，照明點擴散函數(shù)的各向同性得到顯著改善，為實現(xiàn)精準的像素重分配奠定了光學基礎。
活細胞內細胞器的清晰呈現(xiàn)
憑借iISM技術，研究團隊成功實現(xiàn)了對COS-7活細胞內多種細胞器的無標記成像，包括內質網(wǎng)、線粒體、囊泡、肌動蛋白細胞骨架、質膜以及片狀偽足等結構。這些細胞器在圖像中清晰可辨，而且有趣的是，同一類型的細胞器可能呈現(xiàn)出正對比度或負對比度，這反映了它們相對于光學切面的微小軸向位置差異，體現(xiàn)了iISM對納米級三維形貌的固有靈敏度。
在時間序列成像中，研究團隊以約8.2秒每幀的速度連續(xù)記錄了囊泡運動和內質網(wǎng)重塑的動態(tài)過程。紅色箭頭標記的囊泡在細胞質中遷移，內質網(wǎng)小管發(fā)生動態(tài)重組，這些精細的生物學過程均在無標記、低損傷的條件下被忠實記錄。值得注意的是，iISM成像的幀率僅受相機讀取速度的限制，不存在熒光光物理上限的約束，這為其在快速動態(tài)過程研究中的應用打開了廣闊空間。
研究團隊還進一步驗證了iISM與熒光成像的互補性。在固定細胞實驗中，他們分別獲取了同一區(qū)域的iISM無標記圖像和Alexa Fluor 647標記的肌動蛋白熒光圖像，疊加結果顯示兩者具有極好的空間對應關系。更有意義的是，iISM圖像還揭示了一些熒光通道中不可見的未標記結構，如黏著斑和相鄰囊泡，凸顯了無標記散射對比度所提供的額外結構信息。
對于現(xiàn)有的商業(yè)共聚焦熒光IS顯微鏡系統(tǒng)，iISM可通過相對簡單的光學改造實現(xiàn)：將主二色鏡替換為偏振分束器，并在光路中加入四分之一波片即可。這意味著該技術具有較低的轉化門檻，有望快速進入商業(yè)應用階段。從更廣闊的視角來看，研究者展望了將iISM與單分子熒光IS顯微鏡結合的混合策略。這種策略有望將超靈敏散射檢測與分子特異性融為一體，為細胞結構和功能研究提供前所未有的信息維度。
Moerner教授團隊的這項研究，標志著無標記活細胞成像技術邁出了重要一步。通過將干涉檢測與圖像掃描顯微術創(chuàng)造性地結合，iISM在保持約120納米高分辨率的同時，將照明功率需求降低至傳統(tǒng)方法的十分之一，實現(xiàn)了真正意義上的低損傷、長時間活細胞觀察。在這一突破性系統(tǒng)中，Cobolt MLD-06-01激光器憑借其穩(wěn)定的性能和優(yōu)異的輸出質量，為核心實驗提供了可靠的光源保障，助力科學家們在近乎天然的生理條件下，窺見細胞內納米尺度的動態(tài)世界。
