DCS-120 共焦 FLIM 系統專業產品介紹

產品概述

Becker & Hickl 推出的 DCS-120 共焦 FLIM 系統是一套完整的共焦激光掃描熒光壽命成像顯微鏡系統，采用 ps 二極管激光器激發、振鏡快速掃描、共焦檢測和 bh 的多維 TCSPC 技術進行 FLIM 記錄。該系統以優秀的時間分辨率、優秀的重現性、高空間分辨率、高靈敏度和接近出色的光子效率記錄熒光壽命圖像。熒光壽命可檢測到 25 ps，衰變數據可解析為 4096 個時間通道，寬度可達 405 fs，像素格式可增至 2048 × 2048。系統包含顯微鏡和激光器，同時也可用于將現有的傳統顯微鏡轉換為帶有 TCSPC 檢測功能的全功能共聚焦或多光子激光掃描顯微鏡。

系統兼容性與功能特性

DCS-120 系統可用于尼康、蔡司和奧林巴斯的倒置顯微鏡。由于其光束掃描速度快、靈敏度高，該系統可用于活細胞成像。系統功能包括在兩個完全平行的波長通道中同時記錄 FLIM 或穩態熒光圖像、激光波長復用、多波長 FLIM、時間序列 FLIM、通過時間馬賽克 FLIM 進行超快速時間序列記錄、空間馬賽克 FLIM、Z-Stack FLIM、磷光壽命成像（PLIM）、熒光壽命瞬時掃描（FLITS）和 FCS 記錄。

應用重點是代謝成像，即利用熒光團與其分子環境相互作用所產生的壽命變化。典型應用包括離子濃度測量、FRET 實驗、代謝成像、快速生理效應成像和植物生理學。

系統原理與操作模式

系統基于快速振鏡激光掃描、去掃描共焦檢測（DC）和 bh 的多維 TCSPC FLIM 技術。激發采用 ps 脈沖激光器，經光纖耦合輸入，掃描速率可低至約 1 μs/pixel。系統支持的操作模式涵蓋兩個（多）光譜或偏振通道、時間序列、Z-堆棧、馬賽克（X、Y、Z、時間）、激發波長多路復用、FLITS（熒光壽命-瞬態掃描）、與 FLIM 同時進行的 PLIM（磷光壽命成像）、光子相關（FCS、FCCS、門控 FCS），以及單點熒光和磷光衰減測量。

掃描頭與光學系統

掃描頭采用快速振鏡激光掃描光學原理，配備兩個獨立的光纖耦合激光輸入。光學激光功率控制通過連續 ND 濾光片輪實現。激光輸入要求為準直自由光束，或配有直徑為 12 mm 準直器的光纖耦合光束，光束直徑 1 至 2 mm。激光功率調節通過中性密度濾光片輪連續可變。掃描頭通過適配器連接顯微鏡左側端口或頂部端口。

共焦檢測部分配備兩個直接連接的探測器輸出。主分光鏡采用無需對準的可交換式分色鏡，提供長通、多波段、寬波段和多光子選項。二級分光鏡輪內含三個二向色分光鏡、偏振分光鏡，支持 100% 到通道 1 或 100% 到通道 2 的配置。每個通道設有獨立的針孔輪，針孔對準通過電子方式經由壓電微動平臺實現，提供 11 個針孔從約 0.5 到 10 AU 的尺寸選擇。每個通道串聯兩個濾光片滑塊用于發射濾波。該系統可有效抑制散射和雜光。

掃描控制

掃描控制由硬件執行精確激光掃描，快速回掃實現快速采集。幀尺寸范圍為幀掃描 16 × 16 至 4096 × 4096 像素，行掃描 16 至 4096 像素。X 掃描支持連續掃描或逐個像素掃描，Y 掃描為逐行掃描。系統支持軟件控制帶有模擬調制輸入的激光器。激光多路復用支持幀、行、像素和像素內級別，需要軟件控制激光功率。光束消隱在回掃期間和掃描停止時執行，同樣需要軟件控制激光功率。幀頻和掃描速度可自動選擇最快速率或手動選擇，并提供交互式掃描區域選擇、硬件縮放與偏移、快速預覽功能以及交互式測量點選擇的光束駐留功能。

TCSPC 系統配置

系統可選配兩種 TCSPC/FLIM 模塊。SPC-180NX 模塊提供典型值 2 個、最多 4 個并行 TCSPC/FLIM 通道，電氣時間分辨率為 1.6 ps RMS / 3.5 ps FWHM，定時精度為 1.1 ps，最小時間通道寬度為 405 fs，飽和計數率為 12 MHz。SPC-QC-104 模塊提供典型值 2 個、最多 3 個并行通道，電氣時間分辨率為 16 ps RMS / 小于 39 ps FWHM，定時精度為 11 ps，最小時間通道寬度為 4 ps，飽和計數率為 40 MHz（活動通道共享）。激光復用同步最多支持 4 個激光波長，多波長數據可通過路由功能在 16 個通道中同時記錄。實驗觸發功能采用 TTL，用于 Z-Stack FLIM 和顯微鏡控制的時間序列。TCSPC 系統的操作模式包括硬件預分析成像、光子事件流（FIFO）成像、用于相關性的點測量與長時間尺度強度（MCS）、馬賽克成像、時間序列成像、多探測器操作、激光多路復用操作、循環和重復功能以及自動保存功能。

激發源

共焦 FLIM 由 1 至 4 個 BDS-SM ps 二極管激光器激發，可用波長范圍為 375 nm 至 785 nm，重復率為 20、50、80 MHz 和連續波，脈沖寬度為 40 ps 至 100 ps。可選配置包括多光子 FLIM、自由光束或光纖耦合飛秒脈沖激光器、單一波長或可調波長。

探測器選項

共焦檢測器直接耦合到掃描頭，可選 NDD 探測器直接耦合到顯微鏡后端口。標準配置為 HPM-100-40 混合探測器，帶 GaAsP 陰極，波長 250 至 720 nm，最適合與 ns 壽命染料一起使用。可選 HPM-100-06 檢測器，FWHM IRF 寬度小于 20 ps，波長 220 至 650 nm，最適合用于 ps 壽命的自發熒光研究。可選 HPM-100-50 檢測器，波長 400 至 900 nm，最適合長波長熒光研究。另可選配 MW-FLIM GaAsP 多波長探測器。

軟件與數據分析

數據采集軟件為 bh SPCM，并配備用于集成外部設備的 bh LabVIEW，掃描儀控制軟件集成在 SPCM 中。系統支持 Windows 10/11 64 位操作系統，并配備集成式電動樣品臺。數據分析由 bh 最新的 SPCImage NG FLIM 分析軟件執行，該軟件是時域分析和相位分析的結合，通過在 GPU 上運行計算，幾秒鐘內即可得到結果。其他功能還包括通過相位圖或二維時域直方圖進行圖像分割，以及系統 IRF 自動建模，因此無需通過記錄實際 IRF 進行重復校準。函數模型包括 IRF 卷積單、雙或三分量指數衰變、可選擇考慮不完全衰減以及偏移分量模型，采用 MLE（最大似然估計）擬合衰變數據。

技術原理

DCS-120 系統采用共焦檢測解決傳統熒光顯微鏡的焦外模糊問題。顯微鏡物鏡將激光束聚焦到樣品中，來自激光束焦點的光通過顯微鏡鏡頭收集回來，通過二向色鏡與激光束分離，并聚焦到與焦平面共軛的針孔中，只有來自焦平面的光才能通過針孔。共焦檢測與快速振鏡光束掃描相結合，不僅解決了離焦問題，還能避免樣品中的散射光造成像素之間的橫向串擾——掃描系統只記錄當前像素的光，即使部分光在樣品中散射，成像系統也會將散射光子分配到正確的像素上。

與 TCSPC FLIM 相結合時，通過針孔的單光子被檢測到，激發脈沖周期內的光子時間和光子檢測時刻的激光束位置也被確定，并在這些參數上建立光子分布，結果是一個像素陣列，每個像素包含大量連續時間通道中的光子數。TCSPC-FLIM 記錄過程可在任何掃描速率下工作，實現優秀的光子效率，信噪比只取決于樣本的光子率和總的采集時間。通過增加光子分布的額外維度，可以積累多波長 FLIM 圖像、多激發波長圖像、熒光/磷光組合圖像以及樣品中快速生理效應的圖像。