DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統專業產品介紹

產品概述

Becker & Hickl 推出的 DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統是一套完整的多光子激光掃描熒光壽命成像顯微鏡系統，采用飛秒激光脈沖多光子激發、振鏡快速掃描、非掃描檢測（NDD）以及 bh 的多維 TCSPC 技術進行熒光壽命成像。該系統以優秀的時間分辨率、優秀的重現性、高空間分辨率、高靈敏度和接近出色的光子效率記錄熒光壽命圖像。對熒光壽命的檢測可低至 10 ps，衰變數據可解析為寬度低至 203 fs 的 4096 個時間通道，像素格式可增至 2048 × 2048。系統包含顯微鏡和激光器，同時也可作為現有傳統顯微鏡的多光子 FLIM 升級方案，并支持組合式多光子/共焦系統的配置。

系統兼容性與功能特性

DCS-120 MP 系統可用于尼康、蔡司和奧林巴斯的倒置顯微鏡。為了利用多光子激發的高穿透深度，該系統采用了非掃描檢測方式。由于其光束掃描速度快、靈敏度高，DCS-120 系統可用于活細胞成像。系統功能包括在兩個完全平行的波長通道中同時記錄 FLIM 或穩態熒光圖像、激光波長復用、時間序列 FLIM、時間序列記錄、Z-Stack FLIM、磷光壽命成像（PLIM）、熒光壽命瞬時掃描（FLITS）和 FCS 記錄。應用重點是熒光團與其分子環境相互作用而產生的壽命變化，典型應用包括離子濃度測量、FRET 實驗、代謝成像、快速生理效應成像和植物生理學。

激發源配置

DCS-120 MP 多光子熒光成像系統可配備鈦藍寶石激光器和飛秒光纖激光器兩種版本。鈦藍寶石激光器系統具有可調諧性和高激光功率的優點，高功率允許使用 AOM（聲光調制器）進行軟件控制的強度調節、快速光束消隱和像素同步開/關調制，以同時進行 FLIM/PLIM 操作。光纖激光系統結構緊湊，易于使用，幾乎無需維護，波長固定為 780 nm。大多數熒光團的雙光子吸收帶都很寬，足以在此波長下激發，且 780 nm 是激發 NADH 的優異波長，因此光纖激光系統幾乎是出色的多光子代謝-熒光成像系統。激發波長范圍通常從 650 nm 到 1200 nm，激光控制集成在系統軟件中。

系統原理與操作模式

系統基于快速振鏡激光掃描激發、非掃描檢測（NDD）和 bh 的多維 TCSPC FLIM 技術。激發采用 fs 脈沖激光，支持自由光束或光纖耦合輸入，掃描速率可低至約 1 μs/pixel。系統支持的操作模式涵蓋兩個（多）光譜或偏振通道、時間序列、Z-堆棧、馬賽克（X、Y、Z、時間）、激發波長多路復用、FLITS（熒光壽命-瞬態掃描）、與 FLIM 同時進行的 PLIM（磷光壽命成像）、光子相關（FCS、FCCS、門控 FCS），以及單點熒光和磷光衰減測量。

掃描頭與光學系統

掃描頭采用快速振鏡激光掃描激發光學原理，配備兩個獨立輸入，支持光纖耦合或自由光束方式。光學激光功率控制通過連續 ND 濾光片輪實現。激光輸入要求為準直自由光束，或帶 12 mm 直徑準直器的光纖耦合光束，光束直徑為 1 至 2 mm。掃描頭通過適配器連接顯微鏡左側端口或頂部端口。系統提供兩個非掃描檢測通道，通過二向色或偏振分光鏡進行通道分離。

掃描控制

掃描控制由硬件執行精確激光掃描，快速回掃實現快速采集。幀尺寸范圍為幀掃描 16 × 16 至 4096 × 4096 像素，行掃描 16 至 4096 像素。X 掃描支持連續掃描或逐個像素掃描，Y 掃描為逐行掃描。系統支持軟件控制帶有模擬調制輸入的激光器或控制單獨的 AOM。激光復用支持幀、行、像素和像素內級別，需要軟件控制激光功率。光束消隱在飛返期間和掃描停止時執行，同樣需要軟件控制激光功率。幀頻和掃描速度可自動選擇最快速率或手動選擇，并提供交互式掃描區域選擇、硬件縮放與偏移、快速預覽功能以及交互式測量點選擇的光束駐留功能。

TCSPC 系統配置

系統可選配兩種 TCSPC/FLIM 模塊。SP### DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統專業產品介紹

產品概述

Becker & Hickl 推出的 DCS-120 MP 多光子 FLIM 系統是一套完整的多光子激光掃描熒光壽命成像顯微鏡系統，采用飛秒激光脈沖多光子激發、振鏡快速掃描、非掃描檢測以及 bh 的多維 TCSPC 技術進行熒光壽命成像。該系統以優秀的時間分辨率、優秀的重現性、高空間分辨率、高靈敏度和接近出色的光子效率記錄熒光壽命圖像。對熒光壽命的檢測可低至 10 ps，衰變數據可解析為寬度低至 203 fs 的 4096 個時間通道，像素格式可增至 2048 × 2048。系統包含顯微鏡和激光器，也可用于將現有的傳統顯微鏡轉換為全功能的多光子激光掃描顯微鏡。

系統配置與激光器選擇

DCS-120 MP 多光子熒光成像系統可配備鈦藍寶石激光器和飛秒光纖激光器兩種版本。鈦藍寶石激光器系統具有可調諧性和高激光功率的優點，高功率允許使用 AOM（聲光調制器）進行軟件控制的強度調節、快速光束消隱和像素同步開/關調制，以同時進行 FLIM / PLIM。光纖激光系統結構緊湊，易于使用，幾乎無需維護，缺點是波長固定為 780 nm。不過，大多數熒光團的雙光子吸收帶都很寬，足以在此波長下激發它們，且 780 nm 也是激發 NADH 的優異波長，因此光纖激光系統幾乎是出色的多光子代謝-熒光成像系統。

為了利用多光子激發的高穿透深度，DCS-120 MP 采用了非掃描檢測。系統可用于尼康、蔡司和奧林巴斯的倒置顯微鏡。由于其光束掃描速度快、靈敏度高，DCS-120 系統可用于活細胞成像。

系統功能與典型應用

DCS-120 的功能包括在兩個完全平行的波長通道中同時記錄 FLIM 或穩態熒光圖像、激光波長復用、時間序列 FLIM、時間序列記錄、Z-Stack FLIM、磷光壽命成像（PLIM）、熒光壽命瞬時掃描（FLITS）和 FCS 記錄。應用重點是熒光團與其分子環境相互作用而產生的壽命變化，典型應用包括離子濃度測量、FRET 實驗、代謝成像、快速生理效應成像和植物生理學。

系統原理與操作模式

系統基于快速振鏡激光掃描激發、非掃描檢測（NDD）和 bh 的多維 TCSPC FLIM 技術。激發采用飛秒脈沖激光器，自由光束或光纖耦合輸入，掃描速率可低至約 1 μs/pixel。系統支持的操作模式涵蓋兩個（多）光譜或偏振通道、時間序列、Z-堆棧、馬賽克（X、Y、Z、時間）、激發波長多路復用、FLITS（熒光壽命-瞬態掃描）、與 FLIM 同時進行的 PLIM（磷光壽命成像）、光子相關（FCS、FCCS、門控 FCS），以及單點熒光和磷光衰減測量。

掃描頭與光學系統

掃描頭采用快速振鏡激光掃描激發原理，配備兩個獨立輸入，支持光纖耦合或自由光束。光學激光功率控制通過連續 ND 濾光片輪實現。激光輸入要求為準直自由光束，或帶 12 mm 直徑準直器的光纖耦合光束，光束直徑為 1 至 2 mm。掃描頭通過適配器連接顯微鏡左側端口或頂部端口。

掃描控制

掃描控制由硬件執行精確激光掃描，快速回掃實現快速采集。幀尺寸范圍為幀掃描 16 × 16 至 4096 × 4096 像素，行掃描 16 至 4096 像素。X 掃描支持連續掃描或逐個像素掃描，Y 掃描為逐行掃描。系統支持軟件控制帶有模擬調制輸入的激光器或控制單獨的 AOM。激光復用支持幀、行、像素和像素內級別，需要軟件控制激光功率。光束消隱在飛返期間和掃描停止時執行，需要軟件控制激光功率。幀頻和掃描速度可自動選擇最快速率或手動選擇，并提供交互式掃描區域選擇、硬件縮放與偏移、快速預覽功能以及交互式測量點選擇的光束駐留功能。

TCSPC 系統配置

系統可選配兩種 TCSPC/FLIM 模塊。SPC-180NX 模塊提供典型值 2 個、最多 4 個并行 TCSPC/FLIM 通道，電氣時間分辨率為 1.6 ps RMS / 3.5 ps FWHM，定時精度為 1.1 ps，最小時間通道寬度為 405 fs，飽和計數率為 12 MHz。SPC-QC-104 模塊提供典型值 2 個、最多 3 個并行通道，電氣時間分辨率為 16 ps RMS / 小于 39 ps FWHM，定時精度為 11 ps，最小時間通道寬度為 4 ps，飽和計數率為 40 MHz（活動通道共享）。激光復用同步最多支持 4 個激光波長，多波長數據可通過路由功能在 16 個通道中同時記錄。實驗觸發功能采用 TTL，用于 Z-Stack FLIM 和顯微鏡控制的時間序列。TCSPC 系統的操作模式包括硬件預分析成像、光子事件流（FIFO）成像、相關點測量與長時標強度（MCS）、馬賽克成像、時間序列成像、多探測器操作、激光多路復用操作、循環和重復功能以及自動保存功能。

軟件與數據分析

數據采集軟件為 bh SPCM，并配備用于集成外部設備的 bh LabVIEW，掃描儀控制軟件集成在 SPCM 中。系統支持 Windows 10/11 64 位操作系統，并配備集成式電動樣品臺。數據分析由 bh SPCImage NG 執行，該軟件是時域分析和相位分析的結合，通過在 GPU 上運行計算，幾秒鐘內即可得到結果。其他功能包括通過相位圖或二維直方圖進行圖像分割，以及系統 IRF 自動建模，因此無需通過記錄實際 IRF 進行重復校準。函數模型包括 IRF 卷積單、雙或三分量指數衰變、可選擇考慮不完全衰減以及偏移分量模型，采用 MLE（最大似然估計）擬合衰減曲線。

激發源與探測器選項

多光子 FLIM 采用自由光束或光纖耦合飛秒脈沖激光器，支持單一波長或可調波長配置。可選配置為共焦 FLIM，系統中可耦合一個額外的 BDS-SM ps 二極管激光器。

NDD 探測器直接耦合到顯微鏡后端口，可選共焦檢測器直接耦合到掃描頭。標準配置為 HPM-100-40 混合探測器，帶 GaAsP 陰極，250 至 720 nm，最適合與 ns 壽命染料一起使用。可選 HPM-100-06 檢測器，FWHM IRF 寬度小于 20 ps，波長 220 至 650 nm，最適合用于 ps 壽命自發熒光研究。可選 HPM-100-50 檢測器，波長 400 至 900 nm，最適合長波長熒光研究。另可選配 MW-FLIM GaAsP 多波長探測器。

技術原理：多光子激發與優勢

多光子激發利用兩個或多個激發光的光子來激發一個熒光光子。使用飛秒脈沖并通過高數值孔徑顯微鏡物鏡聚焦，可實現高的空間和時間功率密度——脈沖持續時間為 100 fs，重復頻率為 80 MHz，通過 NA = 1.3 的鏡頭聚焦，不超過 5 mW 即可獲得大多數熒光染料的明亮熒光。要獲得可見光區域的熒光，激光波長必須在近紅外區域，鈦藍寶石激光器、OPO 和飛秒光纖激光器可用于產生所需的激發波長。

與單光子激發相比，多光子激發具有多項優勢。首先，樣品在激發波長處的吸收率較低，散射系數也低于可見光或紫外線波長，因此雙光子激發比單光子激發更深入組織。其次，激發被限制在功率密度較高的焦點體積內，在掃描系統中自動意味著激發被限制在焦平面內，無需共焦針孔來阻擋焦平面以外的光線，多光子激發本質上提供了光學切片能力。第三，來自深焦平面的可見光在流出樣品的過程中會發生大量散射，但這種光無法準直，因此無法聚焦到共聚焦針孔中。多光子激發不會激發焦平面外的熒光，使得檢測樣品內部的散射光成為可能——光線可以直接從顯微鏡鏡頭后方轉向探測器，通過投射顯微鏡鏡頭的圖像，散射光子的大部分會被傳送到檢測器，這一原理被稱為非掃描探測。

與 bh TCSPC FLIM 系統結合使用的第四項優勢是高的時間分辨率。激發脈沖具有飛秒脈沖寬度，因此 FLIM 系統的儀器響應函數不會因激發脈沖而變寬。利用快速混合探測器，IRF 寬度可低至 20 ps FWHM，直接記錄超快熒光衰減現象的能力為 FLIM 應用開辟了一個全新的領域。